ABI_7500熒光定量PCR儀是一款廣泛應用于分子生物學實驗中的高精度設備。作為實時熒光定量PCR技術的重要代表,它廣泛應用于基因表達分析、病毒檢測、突變檢測、病原微生物監(jiān)測等領域。
一、熒光定量PCR技術概述
熒光定量PCR(QuantitativePCR,qPCR)是一種用于定量分析特定DNA或RNA樣本的技術。與傳統(tǒng)的PCR技術不同,qPCR通過實時監(jiān)測擴增過程中產(chǎn)生的熒光信號來定量分析DNA或RNA的濃度。此技術通過在PCR反應體系中加入熒光探針或染料,利用熒光信號強度的變化來評估目標基因的擴增過程。
在qPCR過程中,PCR擴增產(chǎn)物的熒光信號會隨著擴增反應的進行而增加,儀器通過監(jiān)測熒光信號的變化,結合標準曲線,能夠精確地計算出樣本中目標基因的相對或絕對濃度。
二、工作原理
ABI_7500熒光定量PCR儀是通過實時監(jiān)測熒光信號的變化來實現(xiàn)PCR反應的定量分析。其基本工作原理包括以下幾個核心步驟:
1.PCR反應體系的建立:首先,研究人員需將DNA樣本、特異性引物、熒光染料(如SYBRGreen)或熒光探針(如TaqMan探針)加入PCR反應體系中。PCR反應體系的組分通常還包括緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶等。
2.熱循環(huán)反應:PCR反應通過溫控系統(tǒng)進行熱循環(huán),通常包括三個階段:變性(95°C),退火(55-65°C),延伸(72°C)。在每個擴增周期結束后,儀器會通過光學系統(tǒng)實時檢測熒光信號的變化。
3.熒光信號的采集:隨著DNA擴增的進行,PCR產(chǎn)物數(shù)量逐漸增加,熒光染料或熒光探針在PCR產(chǎn)物上結合并發(fā)出熒光。ABI7500儀器通過光學模塊檢測反應管內(nèi)的熒光強度,并在每個循環(huán)結束時記錄熒光值。
4.數(shù)據(jù)分析:熒光信號的強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。通過監(jiān)測熒光信號的變化,ABI7500能夠計算出PCR擴增曲線的閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)。Ct值與目標DNA的初始濃度相關,較低的Ct值意味著樣本中目標基因的初始濃度較高。
5.結果解讀:能夠自動生成擴增曲線圖和標準曲線,通過比對未知樣品的Ct值與標準曲線,得到目標基因的定量數(shù)據(jù)。對于定量表達分析,還可以通過相對定量(ΔΔCt法)來計算樣本中目標基因與內(nèi)參基因的表達水平變化。
三、ABI_7500熒光定量PCR儀的技術核心
1.高效的熱循環(huán)系統(tǒng):配備了精準的熱循環(huán)模塊,可以快速、均勻地控制溫度變化,保證PCR反應的高效性和一致性。該系統(tǒng)確保每個擴增周期都能夠實現(xiàn)最佳的反應條件,從而提高了結果的可靠性。
2.精確的熒光檢測:采用高性能的光學系統(tǒng),能夠實時監(jiān)測每個反應管內(nèi)的熒光信號。其采用了多通道熒光檢測,支持SYBRGreen、TaqMan探針等多種熒光探針或染料的應用,具有靈敏度高、背景低、信號穩(wěn)定等優(yōu)點。
3.多重反應能力:能夠進行多重PCR反應,即在同一反應體系中同時檢測多個目標基因。通過使用不同熒光染料或探針,研究人員可以在一個反應管中檢測多個目標,節(jié)省實驗成本和時間。
4.數(shù)據(jù)分析與結果導出:配備了功能強大的分析軟件,能夠自動進行數(shù)據(jù)分析并生成各種報告。通過內(nèi)置的軟件,用戶可以輕松實現(xiàn)數(shù)據(jù)的定量、相對定量分析,以及標準曲線的繪制和結果的統(tǒng)計分析。
四、應用優(yōu)勢
1.高靈敏度:具備高的檢測靈敏度,可以精確測量低濃度的DNA或RNA樣本,適用于微量樣本的定量分析。
2.操作簡便:其友好的用戶界面和智能化的軟件設計,使得操作過程更加簡便易行,降低了操作人員的技術要求。
3.高通量檢測:支持96孔板和384孔板的檢測,適合大規(guī)模樣本的高通量檢測需求,廣泛應用于臨床診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領域。
4.精確的定量結果:通過實時監(jiān)測熒光信號變化,ABI7500能夠提供準確的定量數(shù)據(jù),為基因表達研究、病原檢測等提供可靠依據(jù)。